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        高滲乳酸鈉改善膿毒癥大鼠模型的微循環、心功能和炎癥

        2023-05-13 20:27:25


        高滲乳酸鈉改善膿毒癥大鼠模型的微循環、心功能和炎癥

        摘要

        (1)背景:

        高滲乳酸鈉(HSL)可能在炎癥過程中起作用。我們旨在評估其在大鼠實驗性膿毒癥(盲腸結扎穿刺(CLP))期間的作用。

        (2)方法:

        分三組(n=10/組):假手術組、CLP-NaCl 0.9%和CLP-HSL(CLP后2.5ml/kg/h液體18小時)。評估腸系膜微循環、超聲心動圖、細胞因子和生化參數。對毛細血管滲漏(Evans blue,n=5/組)和心臟血流動力學(n=7/組)進行了另外兩項實驗。

        (3)結果:

        HSL改善了腸系膜微循環、心輸出量和左心室短縮分數。HSL還提高了dP/dtmax斜率,降低了左室舒張末壓-容積關系,并減少了腸道、肺和肝臟中的伊文思藍擴散。乳酸和3-羥基丁酸在CLP-HSL中較高。HSL患者的血漿細胞因子(IL-1β,TNFα,IL-10)以及血漿VEGF-A減少。

        (4)結論

        高滲乳酸鈉液可預防膿毒癥時的心功能不全、腸系膜微循環改變和毛細血管滲漏,同時減少炎癥并增強酮體。




        Material and methods

        前站、隨機、對照的研究設計及倫理


        動物程序

        主要目的是比較HSL和0.9%NaCl對微循環的影響;先前的數據[21],我們預先計算了每組10只雄性Sprague-Dawley大鼠(400-500g)的數量,足以確定微循環流量差異20%,α風險為5%,效能為90%。次要目標是心功能、毛細血管滲漏、炎癥和代謝。由于與微循環研究不兼容,其中一些目標需要額外的動物。根據我們之前的經驗,Evans blue和壓力-容積回路分別為每組5只動物和7只動物。


        實驗流程

        通過盲腸結扎穿刺(CLP)誘導膿毒癥。通過腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪(75/5mg/kg)麻醉動物。將3-F聚氨酯灌注導管插入右頸靜脈。結扎盲腸(占盲腸體積的75%)并刺穿盲腸(16克針頭)以使糞便外部化。在手術結束時,將動物隨機分為四組:接受11.2%乳酸鈉的CLP-HSL(1000 mmol/L鈉+1000 mmol/L乳酸鈉,法國APHP),接受0.9%NaCl的CLP-NaCl(154 mmol/L氯+154 mmmol/L鈉),接受8.4%碳酸氫鈉的CLP-HSB(1000 mmmol/L碳酸氫鈉+1000 mm/L鈉),假手術采用宮頸切開術和剖腹術,但不使用導管/CLP。不幸的是,HSB組6只大鼠中只有2只存活。出于道德原因,并根據為本研究提供的合法授權,我們未完成本組研究。CLP大鼠無法獲得水和食物,并接受了18小時內2.5毫升/千克/小時的研究液體輸注。向CLP-NaCl溶液中添加8%的叔丁基葡萄糖,以產生與CLP-HSL組相同的熱量[20]。實驗中的大鼠被單獨關在籠子里。在使用氯胺酮/甲苯噻嗪(75/5 mg/kg)麻醉后,實現了三組不同的實驗:(1)超聲心動圖和激光斑點成像(n=10/組),(2)伊文思藍測定(n=5/組),或(3)壓力-容積回路(n=7/組)。


        (1)超聲心動圖

        在麻醉下實現超聲心動圖,并使用M模式測量左室舒張末期和收縮末期直徑(LVEDD和LVESD),從而計算左室縮短分數(LVFS)。脈沖波多普勒用于采集和計算二尖瓣E/A比。通過近端肺動脈測量每克動物的心輸出量。


        (2)腸系膜灌注

        超聲心動圖檢查后,通過激光斑點對比成像對腸道進行微循環采集。在遠離空腸部位的四個相似感興趣區域實現圖像分析,平均值表示為灌注單位(PU)。


        (3)毛細血管滲漏和伊文思藍測定

        靜脈注射伊文思藍,45分鐘后用多聚甲醛將其從血流中沖洗掉。心臟(左心室)、肺、腸道和肝臟樣品在60°C下脫水5天,然后在37°C下在10%甲酰胺中孵育3天。使用分光光度法在620nm處測量離心上清液的吸光度。

        在CLP-NaCl和CLP-HSL組中記錄液體平衡(尿量和輸注液體之間的差異)。


        (4)血流動力學

        獲得左心室(LV)的壓力-容積環和血流動力學。記錄/計算左室收縮壓(LVESP)、左室舒張壓(LVEDP)、dP/dtmin、dP/dtmax和左室舒張常數tau(Weiss法)。計算LVESP和LVEDP關系(LVESPVR和LVEDPVR),作為負荷無關的左室收縮功能和左室順應性的指標。在程序結束時采集血樣,使用冷凍滲透壓計測量和比較血漿滲透壓(mosmol/kg)。


        (5)生物學參數

        在手術結束時,采集最大體積的血液。


        (6)炎癥和毛細血管滲漏相關標志物

        IL-1β、TNFα和IL-10;使用ELISA測定血管內皮生長因子A型(VEGF-A)和syndecan-1。


        (7)生物化學

          在血液和尿液中測量尿素、鈉、鉀和氯化物。在血液中測量白蛋白。計算實驗期間排出的離子的絕對量,計算整個實驗期間注入的離子量和排出的離子量之間的差異,并反映出在輸注期間體內過量的離子。


        (8)新陳代謝

        測定血糖、乳酸、丙酮酸、3-羥基丁酸和乙酰乙酸的血含量。


        (9)統計分析

        使用達戈斯蒂諾檢驗評估數據分布,數據以四分位間距[IQ1–IQ3]或標準偏差(±SD)的均值表示。根據分布的正態性,使用非參數檢驗(Kruskal Wallis或Mann-Whitney)或參數檢驗(ANOVA或t-Student)實現組間比較,如果結果顯著,則使用Dunn或Holm-Sidak的多重比較檢驗進行事后分析。實現了兩個比較:CLP-NaCl組與假手術組和CLP-NaCl組與CLP-HSL組。因為我們旨在評估HSL在膿毒癥期間的作用,所以sham和CLP-HSL之間的比較并不相關,可能會降低分析的能力。所有比較均使用Prism v8.0(美國GraphPad)實現。p<0.05被認為是顯著的。如果缺少關于每組實驗次要終點的數據,則應用對照組的中值來支持無效假設。

         



        結果

        在每組22只大鼠中(3組實驗),CLP-HSL組2只和CLP-NaCl組1只在灌注結束前死亡(補充新大鼠)。


        (1)腸系膜灌注

        與假手術組相比,CLP-NaCl組的腸系膜灌注平均值顯著降低(286±129對957±169 PU,p<0.0001)。相反,與氯化鈉相比,HSL顯著增強了CLP大鼠的灌注(712±366對286±129 PU,p=0.0006,圖1)。

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        圖1. 激光散斑成像評價腸系膜微循環

        (2)毛細血管滲漏

        與假手術組相比,CLP-NaCL組的肺(300[253-452]vs.149[83-152],p=0.04),腸道(113[88-189]vs.35[21-41],p=O.009)和肝臟(70[50-89]vs.18[15-26],p=o.02)的伊文思藍擴散增加(圖2)。心臟沒有觀察到差異。相反,在CLP大鼠中,與NaCl相比,HSL導致肺(94[78-136]vs.300[253-452],p=0.006)、腸道(37[31-43]vs.113[88-189],p=0.03)和肝臟(24[14-37]vs.70[50-89],p=0.04)的伊文思藍擴散減少,但心臟沒有。同樣,HSL與NaCl相比顯著改善了流體平衡(? 1.5 [? 1.7至? 0.7]vs.2.0[1.6–2.2]mL/kg/h,p=0.002),HSL大鼠的尿量顯著較高(3.9[3.2–4.1]vs.0.3[0.3–0.8]mL/千克/h,p=0.008)(兩組的輸液量均為2.5 mL/kg/h,如“材料和方法”一節所述)。

        1圖2. 在肺(a)、腸(b)、肝(b)和心臟(d)中使用伊文思藍測定法(n=5/組)檢測毛細血管滲漏。液體平衡結果(e)、尿量和輸注液體結果(f)

        (3)超聲心動圖

        與假手術組相比,CLP-NaCl組的心臟輸出量減少(0.14[0.01-0.18]對0.30[0.26-0.34]mL/min/g,p=0.004),盡管左室短縮分數沒有差異(39[33-52]對44[41-47]。關于我們模型中可用的前負荷靜態指標,CLP-NaCl組與假手術組相比LVEDD降低(6.2[5.2–7.3]vs.9.4[8.8–9.6]mm,p=0.001),但在E/A二尖瓣血流比方面沒有觀察到差異(1.3±0.4 vs.1.7±0.5,p=1.2)。

        HSL vs.NaCl顯著改善了高心排血量(0.34[0.28–0.43]vs.0.14[0.01–0.18]mL/min/g,p<0.0001)和短縮分數(55[46–73]vs.39[33–52]%,p=0.009)的CLP大鼠的左室收縮功能。未觀察到與預負荷靜態指數相關的差異。

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        圖3 經胸超聲心動圖

        (4)LV pressure-volume loops

        與假手術相比,CLP-NaCl組平均動脈壓、舒張動脈壓、系統動脈壓和脈搏動脈壓降低。壓力描記顯示,由于心室向力性降低,dP/dtmax和LVESP降低。然而,LVESPVR無差異,表明向力性的改變可能與心臟前負荷和/或后負荷的改變有關。相反,在CLP-NaCl大鼠中,dP/dtmin和LVEDPVR發生了改變,表明心室順應性的改變,與心臟前負荷無關。與NaCl相比,給予HSL不會導致不同水平的動脈血壓,但dP/dtmax更高,LVESPVR無差異,這表明向力性有所改善,但可能與前負荷增加有關。LVEDPVR的降低表明心室順應性的改善依賴于心臟前負荷/后負荷。在本實驗中,CLP-NaCl與假手術大鼠之間以及CLP-NaCl與CLP-HSL大鼠之間的血漿滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)沒有變化(表1)。

        1:有創血流動力學參數和壓力-容積回路(n=7/組)

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        (5)生物學參數

        結果如表2所示。在CLP大鼠中,輸注HSL與血漿鈉濃度和尿鈉排泄顯著升高相關,而血漿氯和鉀降低。ΔNa+,代表輸注期間體內鈉的累積,在CLP-HSL和CLP-NaCl組之間沒有顯著差異。與假手術組相比,CLP-NaCl中的尿素含量是假手術組的兩倍,而HSL導致較低的血漿水平。與假手術組相比,CLP-NaCl組白蛋白減少,但與CLP-HSL組相比沒有。

        關于代謝,CLP-NaCl組與假手術組相比,血糖降低了兩倍,血漿3-羥基丁酸減少。相反,與NaCl相比,HSL與較高的血糖、乳酸、丙酮酸和3-羥基丁酸的血漿水平相關,但兩組之間乳酸/丙酮酸比率沒有差異。

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        (6)炎癥

        與假手術組相比,CLP-NaCl組炎癥反應增強,細胞因子IL-1β、TNFα和IL-10顯著升高(圖4,表2)。與NaCl相比,HSL降低了血漿中IL-1β、TNFα和IL-10的水平。

        假手術組、CLP-NaCl組和CLP-HSL組之間的VEGF-A或syndecan-1無差異,但CLP-NaCl組與CLP-HSL組之間的VEGF-A水平降低。

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        總結:總之,在實驗性膿毒癥模型中使用高滲乳酸液體可以改善微循環、毛細血管滲漏以及心臟和腎臟功能,可能通過代謝和炎癥途徑實現。實驗和臨床研究都有必要深化HSL改善膿毒癥的機制,以及可能轉移到臨床膿毒癥的治療上。

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